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保存條件 

      常溫10~25℃保存 12 個月蛋白酶 K -20℃保存。 

產品簡介 

      本試劑盒可從≤20 mg 動物軟組織(肝臟、脾臟、腎臟腦等) 、≤1×107 個培養(yǎng)細胞中快速提取 總 RNA。試劑盒基于硅膠柱純化技術提取過程中無需使用 DTT 及 β-巰基乙醇整個提取過程可在 30 min 內完成。試劑盒結合 DNA 過濾技術可高效地過濾去除基因組 DNA提取的總 RNA 純度 高無蛋白和其它雜質的污染可用于 RT-PCR、Northern Blot、Poly A 純化、RNase 保護分析和 體外翻譯等實驗。

產品特點 

操作簡便30 min 內完成數(shù)個樣品的總 RNA 提取 

高效去除基因組 DNA獨特的基因組 DNA 過濾柱無需 DNase 處理 

安全低毒無需 DTT 及β-巰基乙醇等有毒試劑 

RNA 純度高提取的 RNA 無雜質殘留適用于對純度、完整性要求很高的下游實驗。

適用范圍 

       本品適用于動物軟組織、細胞等樣品的總 RNA 提取。

注意事項 

   1. 第一次使用前應在漂洗液 Buffer FRW1 中加入 48 mL 的無水乙醇

   2. 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌、汗 液及 RNase 等可能導致 RNA 降解 

   3. RNA 在裂解液 FRL 中時不會被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含 RNase 的塑 料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min然 后用水徹底清洗、滅菌 

   4. 配制溶液如 70%乙醇應使用 RNase-Free ddH2O將水加入干凈的玻璃瓶中加 DEPC 至終濃 度為 0.1%(V/V)混勻放置過夜后高壓滅菌。 

使用方法 

一、從動物組織中提取總 RNA 

   1. 每 10~20 mg 組織加 350 μL Buffer FRL用電動勻漿器將組織徹底勻漿, 然后加入 10 μL  Proteinase K混勻后室溫放置 5 min 

注意脾臟組織建議使用 5 mg肌肉類的組織可以增加到 50~100 mg。 

   2. 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2~5 min取上清按第 3 步進行操作 

二、從培養(yǎng)細胞中提取總 RNA 

       本產品單次可處理 102~107 個細胞。初次使用時建議使用 2~5×106 個細胞。根據(jù)結果再調整 細胞量。但不論何種情況細胞量不要超過 1×107。 

   1. 加入適量的 Buffer FRL 至細胞樣品中打散細胞 

   1) 懸浮細胞離心收集的細胞彈打或渦旋松散細胞沉淀加入適量 Buffer FRL 和 10 μL Proteinase K渦旋或用移液槍吸打打散細胞。

   2) 貼壁細胞可直接在培養(yǎng)容器中裂解容器直徑不超過 10 cm或者使用胰蛋白酶處理后離心 收集細胞沉淀。

    a. 直接裂解法徹底吸棄培養(yǎng)液向培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入適量的 Buffer FRL 和 10  μL Proteinase K。

    b. 胰蛋白酶處理法徹底吸棄培養(yǎng)液用 PBS 洗滌細胞吸除 PBS加入含有 0.10%~0.25% 胰 蛋白酶的 PBS 處理細胞當細胞脫離容器壁時加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶將細胞溶 液轉移至 RNase-Free 的離心管中300×g 離心 5 min收集細胞沉淀仔細吸除所有上清加 入適量的 Buffer FRL 和 10 μL Proteinase K。

   2. 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2~5 min取上清按第 3 步進行操作 

注意樣品量過多裂解不充分會導致裂解液粘稠堵塞 gDNA 過濾柱如果裂解液非常粘稠可適當增加 裂解液用量。

   3. 把 RNase-Free gDNA Remove Column 放在 2 mL 收集管中把細胞裂解液或組織上清液轉 移至 gDNA 過濾柱中12,000 rpm (~13,400×g) 離心 30 s保留濾液

注意組織裂解液需高速離心去除雜質細胞碎片會引起柱子的堵塞。處理某些樣品時離心后裂解液表 面還可能會有一層脂類層轉移上清液盡量不要吸到這些物質。若 gDNA 過濾柱堵塞可將濾液吸出加 入適量裂解液勻漿后再轉移至新的 gDNA 過濾柱中。

   4. 丟棄 gDNA 過濾柱濾液中加入等倍體積 70%乙醇用移液槍吸打 3~5 次 

   5. 把 RNase-FreeRNA Column 放在 2 mL 收集管中將溶液和沉淀一起轉移至吸附柱中。 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 30 s倒掉收集管中的廢液把吸附柱放回收集管中 

   6. 如不進行 DNase I 消化加入 700 μL Buffer FRW 至吸附柱上12,000 rpm (~13,400×g) 離 心 30 s倒掉收集管中的廢液把吸附柱放回收集管中 

   7. 可選若后續(xù)實驗對 RNA 純度比較嚴格可選擇使用 DNase I需另外訂購進行膜上 DNase 消化 

    1) 向 RNase-Free 吸附柱中加入 350 μL Buffer FRW12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 s棄廢 液將吸附柱放回收集管中

    2) 向吸附柱中央加入 DNase I 工作液室溫放置 15 min 

    3) 向 RNase-Free 吸附柱中加入 350 μL Buffer FRW12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 s棄廢 液將吸附柱放回收集管中 

    8. 加入 500 μL Buffer FRW1使用前請先檢查是否加入乙醇至吸附柱中室溫靜置 2 min12,000  rpm (~13,400×g) 離心 30 s倒掉廢液把吸附柱放回收集管中 

    9. 重復步驟 8 

  10. 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2 min倒掉廢液將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘以徹底晾干 吸附材料中殘留的漂洗液 

注意此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除漂洗液的殘留可能會影響后續(xù)的 RT 等實驗。 

  11. 將吸附柱轉移至新的 RNase-Free 離心管中向吸附膜的中間部位懸空滴加 30~100 μL RNaseFree ddH2O室溫靜置 2 min12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2 min得到 RNA 溶液將洗 脫的 RNA 溶液置于-80℃保存。

注意洗脫緩沖液體積不應少于 30 μL體積過小影響回收效率。 

常見問題與解決辦法 

 Q1柱子出現(xiàn)堵塞 

 A1

     1) 樣品過量。裂解液粘稠減少樣品量或加大裂解液用量樣品量過多反而會降低產量和純度 

     2) 裂解液離心不充分。組織裂解液需高速離心去除雜質雜質會引起柱子的堵塞轉移上清液盡量 不要吸到雜質 

     3) 離心溫度過低。本產品使用操作均在室溫下進行。

 Q2RNA 提取過程中 gDNA 過濾柱堵塞

 A2 

     1) 增加離心次數(shù)、時間或轉數(shù) 

     2) 可將濾液吸出加入適量裂解液勻漿后再轉移至新的 gDNA 過濾柱中。